Kvantifikácia nukleových kyselín v spektrofotometroch
Kvantifikácia nukleových kyselín je najčastejšie používanou funkciou spektrofotometra. Oligonukleotidy, jednovláknová, dvojvláknová DNA a RNA sa môžu kvantifikovať v pufroch. Absorpčný pík najvyššieho absorpčného piku nukleovej kyseliny je 260 nm. Každá nukleová kyselina má odlišné molekulové zloženie, a preto má rôzne konverzné faktory. Ak chcete kvantifikovať rôzne typy nukleových kyselín, vyberte príslušné koeficienty vopred. Napríklad absorbancia lOD je ekvivalentná 50 ug / ml dsDNA, 37 ug / ml ssDNA, 40 ug / ml RNA a 30 ug / ml Olig. Hodnota absorbancie po skúške sa prepočíta vyššie uvedeným koeficientom, aby sa získala zodpovedajúca koncentrácia vzorky. Pred testovaním zvoľte správny postup, zadajte objemy zásobného roztoku a riedidla a otestujte roztoky slepého pokusu a vzorky. Avšak pokus nebol ľahký. Nestabilné hodnoty môžu byť najväčšou bolesťou hlavy pre experimentátorov. Čím vyššia je citlivosť nástroja, tým väčšia je vystavená absorpčná odchýlka.
V skutočnosti princíp konštrukcie a pracovný princíp spektrofotometra umožňujú zmenu hodnoty absorbancie v určitom rozsahu, to znamená, že nástroj má určitý stupeň presnosti a presnosti. Napríklad presnosť Eppendorf Biophotometer ≤ 1,0% (1A). Výsledky týchto viacerých testov sa pohybujú medzi priemerom 1,0% a všetky sú normálne. Okrem toho sa musia vziať do úvahy fyzikálno-chemické vlastnosti nukleovej kyseliny, pH pufra na rozpustenie nukleovej kyseliny, koncentrácia iónov atď. Počas testu príliš vysoká koncentrácia iónov spôsobí, že hodnota drift ako TE, čo značne stabilizuje čítanie. Zriedená koncentrácia vzorky je tiež nezanedbateľným faktorom: v dôsledku nevyhnutnej prítomnosti malých častíc vo vzorke, najmä vzoriek nukleových kyselín. Prítomnosť týchto malých častíc zasahuje do testovacieho efektu. Na minimalizovanie vplyvu častíc na výsledky testu sa vyžaduje, aby absorbancia nukleovej kyseliny bola aspoň 0,1 A a absorbancia je výhodne 0,1 až 1,5 A. V tomto rozmedzí nesmú byť žiadne bublinky zmesi a v polotovare nie je žiadna suspenzia. V opačnom prípade sa čítajú údaje prudko; na otestovanie slepého pokusu a vzorky sa musí použiť rovnaký kolorimetrický pohár; inak je rozdiel koncentrácie príliš veľký; konverzný koeficient a jednotka koncentrácie vzorky sú rovnaké; Kyveta opotrebovaná oknom; objem vzorky musí dosiahnuť viac ako požadovaný minimálny objem farebného pohára atď.
Okrem koncentrácie nukleovej kyseliny spektrofotometer vykazuje súčasne niekoľko veľmi dôležitých pomerov na označenie čistoty vzorky, ako je pomer A260 / A280, na účely stanovenia čistoty vzorky, pretože absorpčný pík proteínu je 280 nm. Čisté vzorky majú pomer väčší ako 1,8 (DNA) alebo 2,0 (RNA). Ak je pomer menší ako 1,8 alebo 2,0, indikuje prítomnosť proteínových alebo fenolických látok. A230 naznačuje, že vo vzorke sú niektoré nečistoty, ako sú uhľohydráty, peptidy, fenoly atď. Pomer čistých nukleových kyselín A260 / A230 je väčší ako 2,0. A320 detekuje zákal roztoku a iné interferenčné faktory. Čistá vzorka A320 je všeobecne 0.
Spoločnosť sa špecializuje na predaj spektrofotometrov , privíta zákazníkov, ktorí potrebujú poradiť a nakupovať, poskytneme vám úprimné služby a kvalitné výrobky, ako aj nižšie ceny.
E-mail: info@sumerlab.com
Web: sumerinstrument.com