Kvantifikácia spektrofotometrických kolorimetrických proteínov
Proteíny sú zvyčajne zmesou bielkovín. Kolorimetrické testy sú založené na zložkách proteínu: Aminokyseliny (napr. Tyrozín, serín) reagujú s ďalšou chromogénnou skupinou alebo farbivom, aby vytvorili farebný materiál. Koncentrácia farebného materiálu priamo súvisí s počtom aminokyselín, ktoré proteín reaguje, čo odráža koncentráciu proteínu.
Kolorimetrická metóda
Existuje niekoľko metód, ako BCA, Bradford a Lowry.
Metóda Lowryho: založená na najskoršej biuretovej reakcii a zlepšená. Proteín reaguje s Cu2 za vzniku modrej reakcie. Avšak metóda Lowry je citlivejšia ako Biuret. Nevýhodou je potreba postupne pridávať niekoľko rôznych činidiel; reakcia trvá dlho; je náchylný na nebielkovinové látky; proteíny obsahujúce EDTA, Triton x-100 a síran amónny nie sú vhodné pre tento spôsob.
Test na bikinchoniinínovú kyselinu: Toto je novší, citlivejší test na bielkoviny. Analyzovaný proteín reaguje s Cu2 v alkalickom roztoku za vzniku Cu, ktorý tvorí chelát s BCA za vzniku fialovej zlúčeniny s absorpčným pikom pri 562 nm. Lineárny vzťah medzi koncentráciou tejto zlúčeniny a proteínu je silný a zlúčenina vytvorená po reakcii je veľmi stabilná. Vzhľadom na metódu Lowry je operácia jednoduchá a citlivosť je vysoká. Avšak, podobne ako Lowry metóda, je náchylný k interferencii s bielkovinami a detergenty.
Bradfordova metóda: Princíp tejto metódy spočíva v tom, že proteín reaguje s Coomassie Brilliant Blue za vzniku farebnej zlúčeniny, ktorá absorbuje pri 595 nm. Jeho najväčšou črtou je citlivosť, ktorá je 2 krát vyššia ako u Lowryho a BCA. Je to jednoduchšie a rýchlejšie. Vyžaduje len jeden druh reakčného činidla. Zlúčenina môže byť stabilná 1 hodinu, aby sa uľahčil výsledok; Pri zasahovaní do systému Lowry BCA reaguje s redukčnými činidlami (napr. DTT, merkaptoetanol). Je však stále citlivý na detergenty. Hlavnou nevýhodou je, že rozdielne normy môžu viesť k veľkým rozdielom vo výsledkoch tej istej vzorky a nemajú žiadne porovnateľné výsledky.
Niektorí výskumní pracovníci, ktorí sú po prvýkrát vystavení kolorimetrickým meraniam, môžu byť zmätení výsledkami rôznych kolorimetrických testov. Aké metódy považujete za zmätené? Vzhľadom na skutočnosť, že skupiny reagujú rôznymi spôsobmi a chromogénne skupiny nie sú rovnaké, súčasne sa používa niekoľko metód na to, aby koncentrácie vzorky tej istej vzorky boli nekonzistentné. Napríklad Keller a kol. testovali proteín v ľudskom mlieku a zistili, že koncentrácie namerané Lowrym a BCA boli významne vyššie ako koncentrácie v Bradforde. Rozdiel bol významný. Aj keď je určená tá istá vzorka, štandardná vzorka vybraná rovnakou kolorimetrickou metódou je nekonzistentná a koncentrácia po teste je tiež nekonzistentná. Napríklad použite Lowryho na testovanie proteínu v bunkovom homogenáte s použitím štandardného BSA s koncentráciou 1,34 mg / ml a štandardným globulínom s koncentráciou 2,64 mg / ml. Preto pred výberom kolorimetrickej metódy je lepšie odkázať na chemické zloženie testovanej vzorky a nájsť chemicky podobný štandardný proteín ako štandard. Okrem toho kolorimetrická metóda na kvantifikáciu proteínov často spôsobuje problémy v tom, že hodnota absorbancie vzorky je príliš nízka, čo vedie k veľkému rozdielu medzi nameranou koncentráciou vzorky a skutočnou koncentráciou. Kľúčovou otázkou je, že farba dôležitej časti spektrofotometra 1011, kyvety, má určitý polčas, takže každá kolorimetrická metóda uvádza reakčný testovací čas. Všetky vzorky (vrátane štandardných vzoriek) musia byť testované v tomto čase. Ak je čas príliš dlhý, dosiahne sa hodnota absorbancie menšia a hodnota premenenej koncentrácie sa zníži. Okrem toho sú všetky dôležité faktory, ktoré ovplyvňujú experiment, reakčná teplota, hodnota pH roztoku atď. Okrem toho je veľmi dôležité používať plastovú kolorimetriu. Nepoužívajte kyvety vyrobené z kremeňa alebo skla, pretože farba po reakcii spôsobí sfarbenie kremeňa alebo skla, čo má za následok nepresnú absorbanciu vzorky.
Spoločnosť sa špecializuje na predaj spektrofotometrov , privíta zákazníkov, ktorí potrebujú poradiť a nakupovať, poskytneme vám úprimné služby a kvalitné výrobky, ako aj nižšie ceny.
E-mail: info@sumerlab.com
Web: sumerinstrument.com